Identificación de sustratos fosforilados por la PKA de Yarrowia lipolytica mediante técnicas de proteómica comparativa

Abstract

La proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es una enzima que se encarga de transferir grupos fosfato de un ATP a sus proteínas diana; su actividad se encuentra regulada por la concentración intracelular de AMPc. En Yarrowia lipolytica, un hongo dimórfico de interés biotecnológico, se encontró que la PKA está involucrada en la morfogénesis, en el metabolismo celular y en la adaptación a condiciones de estrés, y que las subunidades regulatoria y catalítica de la misma se encuentran codificadas por genes únicos: RKA1 y TPK1 respectivamente. En este trabajo se pusieron a punto diversas técnicas de proteómica y biología molecular con el fin de identificar posibles proteínas diana de la PKA de Y. lipolytica. La estrategia utilizada se basó en la comparación de proteínas inmunoenriquecidas con un anticuerpo anti-fosfoSustrato de la PKA de una cepa sin actividad PKA (∆tpk1) y una salvaje. En primera instancia se estandarizó el protocolo de unión entre la resina proteína A-sefarosa y un anticuerpo anti-fosfoSustrato de la PKA, con la cual, en segundo lugar, se enriquecieron las fosfoproteínas provenientes de la cepa salvaje y la mutante, resolviéndose posteriormente por electroforesis bidimensional 2D-PAGE. Por último, se seleccionaron los spots diferencialmente encontrados en la cepa salvaje y se identificaron las proteínas por espectrometría de masas MALDI-TOF. Así, se pudieron identificar 3 proteínas: la propia subunidad regulatoria de la PKA, Rka1; una proteína putativa con homología con la monooxigenasa de la biosíntesis de ubiquinona Coq6 de Saccharomyces cerevisiae, y el factor de elongación traduccional EF1-α